要点⑤：试剂的稀释
试剂稀释的准备工作
1. 检查需要稀释的试剂。
2. 试剂盒中需要恢复至室温的试剂要提前恢复至室温。特别是冬季和早春季节，试验台的表面温度即使在暖气房也不会马上上升。可在试验台上铺上吸水纸后再放上试★剂盒内试剂，待恢复至室温。
3. 试剂原液分装前需充分搅拌均匀，注意避▓免产生气泡。
4. 标记试剂等液量较少的试剂搅拌后短暂离心，待盖子、瓶壁上粘附物质滑落后取用。
5. 用缓冲液稀释试剂原液1000倍以上时，推荐使用分步稀释「。
例：10倍稀释
试剂原液20μL+ 缓冲液180μL
试剂原液10μL+ 缓冲液90μL
例：1000倍稀释
10倍稀释溶液100μL+ 缓冲液9,900μL
可以从10,000μL缓※冲液中吸走100μL，之后加入100μL试剂原液。
稀释后充分搅拌，注意避免产生气泡。
6. 试剂根据需要现用现▅配。
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要点⑥：边缘效应
位于孔板外围的孔位与内部孔位相←比，容易受到▲外部温度的影响，造成反应过度或者反应过慢等现象。
一般来说，在冰箱中保存╲的孔板、试剂、样本，如果在低于室温的状态下使用，外围升温①快，反应加速，吸光度变高。显色液在较低温度使用时显色效果更明显。冬天容易受加热器或ω 空调暖风的影响；夏天容易受空调冷风的影响。所以，可能会造成孔板中空白对照孔（浓度0）的吸光度高于最低浓度的标准溶液（加热时）；或设置』复孔的标准品在测定时，边缘的空白对照孔的吸光度也会受到影响。
边缘现象解♀决办法
1. 测量前1.5h~2h，把孔板、试剂和样品从冰箱中取出，恢复到合适的反应温度。
2. 测量开始前检查试剂的温︾度。
3. 不要在受空调、恒温浴、PC、人等热源♀影响的地方进行测量。
4. 保持恒定的反应温度。
5. 特别需要注意清洗液的使用∏温度。清洗液用量较多，调整温度时需要花费时¤间。如果清洗液的温度与反应温度不同，每次洗涤时，孔板的温度都会改▂变。
6. 使用封板膜◤或板盖。
7. 尽量保持孔板温度传递稳∮定。
8. 使＠ 用恒温箱时，缓冲液和清洗液△也需放入恒温箱内。
*实验前请确认试剂的稳∩定性。
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要点⑦：洗板
洗板是ELISA操作中非常重ㄨ要的步骤之一。如果清洗不彻底会由于非特异性反应造成孔板吸光度上升，无法保证低浓度测定范围内的灵敏度。为防止№出现以上状况必须严格按规范进行清洗操☆作。
【清洗要点（手动洗板）】
1. 如果包含浓╱缩清洗液，需待纯净水的温度恢复至室温后稀释。液体的温度变化比室温慢，操作开→始时清洗液的温度可能与反应温度不同。若使用预先准备好的纯净水需特别注意，建议操作前要测量温度。
2. 使用恒温箱，将洗涤液也放入箱内，尽量保持与反应温度一致。
3. 加入样品、标准品，在指定时间完成卐反应后的第一次洗板：倒掉反应液，让孔板每个孔都充入『清洗液，注意避免清洗液溢出、飞溅或窜孔。每孔的清洗液大概在250 ?300μL。从第二次◥洗板开始，清洗液溢出也没关系。
4. 洗板时，需要一定强度的水流才能充分洗涤孔板，否⊙则会引起清洗不足。特别是使用8道、12道移□液器操作的时候，避免清洗不足情况发生。
5. 过氧化物酶结合物反应后的清洗步骤很重要。使用移液器向孔板中加入清洗液时容▂易造成清洗不足ㄨ，需增加☉清洗次数。（例如，指定清洗4次需要加到6~8次）。
6. 清洗液填满孔板后在手♀掌上朝水平方向以画圆方式轻微晃动5~10秒◥后立刻翻转孔板把清洗液倒出，这样可以加强清洗效果。
7. 洗净后，不要让孔板内的液体干燥，否则会造成空白对照测定值增加。洗板操作开始前必须↓准备好后续操作需要使用的试剂。
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ELISA疑难解答
A：显色时颜色浅或不显色的原因和对策
1. 未╲加入标准品或样品
2. 未加入与显色相关的试剂
①生物素标记》抗体
②过氧化物酶结合抗体
③抗生物素蛋白HRP
④TMB
3. 错用显色相关溶液或者稀释不均的生物︼素抗体⌒ 、抗生物素蛋白HRP等
4. 酶抑制剂的污染
稀释用容器粘附叠氮钠（NaN3）会造成抗生物素蛋■白HRP失活。
*叠氮钠作为防腐剂经常被加在各▽种溶液中（特别是缓冲液）。特别注意装过这些溶液的容器。使用含有抗凝血剂NaF的采血管或含叠氮钠的样◢品时，在抗原抗体反应后、应尽量清洗干净或避免使用该类样本。
5. 孔板的清洗
自动清洗机的清洁♂力度调节过大会剥离固相的抗体或反应』物。需设定适当的清洗ξ强度。建议清洁时设定为平板清洗模式。
人工清洗时，使用移液▂器或洗瓶管嘴不要接触孔表面。
用喷射瓶清洗十分便利。
6. TMB溶液从冰箱取出后可马上加入吗？
没有充分恢复至室温会造成显色弱（室温反应】下）。
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B：肉眼可见显色但无法测量吸光度的原因和对策
可能是读板器测量波长的偏差，需调整读板器的波长。使用滤㊣ 光式读板器检查波长是否正确。
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C：标准曲线不好的原因和对策
○标准曲线没有向右上移
全部吸光度低
样品是▓显色的
→ ●未加入标准品??●未加入标准品原液??●加错标准品原液
○样品不显色
→?●显色剂稀释╳错误??●加错显色剂??●加错第2抗体??●漏加第2抗体??●第2抗体变质、稀释错误?
○全部吸光度低
→?●显色剂变质（氧化）
○标准曲↑线向右下移
→?●标准曲线的添加顺【序弄反
○标准曲线凹凸不平
→?●稀释标准品过程出现错误
○标准曲线在右侧，无法检※测灵敏度
→?●标准品失去活性??●反应时间错误
○包括空白对照（浓度0），设置复孔的标准品在测定时，周围卐板孔的吸光度总是高于内侧板孔测定的吸光度。
→?●可能是边缘现象引起的。
○一般注意事项
使用标准品原液前请先用漩涡振荡器充分混匀，注意不要起泡。
稀释标准品▅溶液时，吸取高浓度∏的标准品溶液加入后续装有缓冲液的试管后，充分混匀后再进行下一步操作。
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本文是在若林克己著《ELISA A to Z》（Shibayagi株式会社发行）基础上，Shibayagi株式会社进行〖编辑的。
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