摘? 要

2016年3月，华南某猪场发生水疱性疾病。经实验室PCR诊断，排除FMDV后显示为SVV阳性。使用PK-15细胞进行病毒培养和传代，采用特异性的VP1基因引物扩增该片段，使用DNAMAN 7.0和MEGA 6.06软件进行同源性分析。

结果表明，该病毒可以在细胞上成功繁殖，成功克隆了该病毒的VP1基因，序列长度ξ为694bp，并进行基因测序和遗传进化分析。序列同源性分析显示：该毒株与国内其他毒株亲缘关系较远，单独形成一个♂分支。表明该毒株为塞内加谷病毒的新成员，命名为SVV HN16。

关键词

猪；塞内加谷病毒；分离鉴定；序列分析

塞内加谷病毒（Seneca?Valley?virus，SVV)又名塞内加A病毒（Senecavirus?A，SVA），为单股正链不分节的RNA病毒，隶属小RNA毒科Senecavirus病毒属。症状与口『蹄疫相似，其主要通过感染仔猪使其猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡。该病↘毒最早于1998年被分№离到，因其在2014年巴西大规模暴发才被养猪业所重视。2015年3月，该病首次在我国广东某猪场暴发，并从发病病料分离到了SVV。

2016年3月华南某集约化猪场肉猪和母猪群「暴发水疱性疾病，发病率100%、病死率约40%。发病猪的病料经多项技术和实验排除了FMDV、SVD等类似▲病原存在，证实这是一起单纯SVV引起的暴发，并对该病毒进行细胞培养和分离鉴定，为该病的防控提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料与细●胞系

本研究从华南某猪场（2?500头基础╲母猪）3～7日龄的乳猪中，采集鼻吻、蹄冠部位出现水疱样病变的仔猪内脏及水疱液，按1∶3加入PBS缓冲液〒进行稀释研磨，6?000g，4℃离心5min，取上清，于-80℃冰箱储存备用。PK-15传代细胞系由华南农业大学兽医学院传染病教研室保☆存。

1.2　主要试剂

One-step?RT-PCR试剂盒、DNA?Marker、dNTP、Taq酶等购自宝生物工程（大连）有限公司，pMD18-T载体、DH5α感受』态细胞、Trizol试剂、质粒提取试剂盒购自Omega公司，DNA产物纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司，CO2培养箱、DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清购自赛默飞世尔仪器有限公司，倒置显微镜为徕卡仪器有限※公司，其他所用化学试剂都为分析纯。引物合成、DNA测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

1.3　引物设计与合成

本实验室↘根据GenBank所发布的序列号，选择全基因序∏列，运用Primer?Premier5.0针对SVV、FMDV（O、A、Asia1通用↑检测型） 分别设计引物，扩增片段Ψ 分别为700bp和350bp，退火温度分别为58℃和54℃。引物由睿博兴科生物技术有限公司合成。

1.4　总RNA的提取

将病料离心后取出上清，按Trizol法提★取病毒总RNA，然后用无RNA酶的去离子水溶解，-80℃冰箱保存。具体步↓骤参照Trizol试剂说明书。

1.5　病毒的RT-PCR检测

以病毒总RNA为模板进行RT-PCR扩增，反应体系为：One-step?RT-PCR?buffer12.5μL，上〓下游引物各1.0μL，RNA模板3μL，Rnase?Free?DH2O 7.5μL。PCR扩增程◆序为：50℃?30min；95℃预变性5min；95℃变性30s；54℃退火3s；72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取5μL?PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，CLINX凝胶成像系统拍照ζ　观察。

1.6　病毒的分【离

取离心后保存的上清液用0.22μm无菌过滤⌒器过滤除菌，取适量过滤后的病毒液加入到铺满单层细胞的细胞◇板上。37℃温箱孵育60min，再加入2%血清培养的DMEM 37℃，培养48h后收毒。在下一次传代前，先将细胞培养物反复冻融3次，取上清液接︽种细胞进行传代，在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE) 并记录。

1.7　克隆测序

将阳性PCR产物经纯〖化回收后与pMD-18T?载体连接，转★化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养后挑单个菌落进行PCR鉴定，鉴定成功的重※组质粒送往睿博兴科生物技术有限公司々进行测序。

1.8　序列分析

将RT-PCR扩增获得的基因片段进行克隆、测序，利用DNAMAN 7.0和MEGA 6.06软件处理，与GenBank上已公布的SVV毒株的全基因序列进行同源性比对▅分析，并绘制系统进化树。

2　结果与分析

2.1　病料RT-PCR检测结果

图1　SVV?VP1基因PCR扩增结果

以提☉取的总RNA为模板，用SVV和FMDV引物分别对样品进行以上2种病毒的①检测。结果如图1所示，FMDV检测结果为阴性，SVV在700bp左右有明显条带，检测结果为阳性。由此说明该→病毒为SVV而非FMDV。将SVV?VP1基因PCR产物纯化后构建↘至pMD-18T质粒并进行♂测序。

2.2　SVV?CH_GDHS_2017的分离

病毒接种单层PK-15细胞，24h时开始出现病变，48h收毒。随着传代次数的增加，出现CPE的时间缩※短且程度随之加剧。目前病毒已传至∩第8代，基本能在该细胞系上稳定增殖。病毒传至24h时有︾细胞变圆，折光性变强，有较多漂浮的死细∑胞；而对照细胞生长良好 ( 图2A，2B)。

图2

A为接毒24h；B为对照24h

C为接毒48h；D为对照48h

培养48h，细胞CPE达75%以上，细胞基本变圆且有大量漂浮的死细胞；对照仍是致密的单层细胞，只有少量的细胞漂浮在液々面（图2C，2D）。每隔2代进行PCR检测，结果ζ均为阳性。由此，可以确定成功分离了一株SVV?HN16毒株。

2.3　SVV?VP1基因同源性分』析

将测序结◤果在NCBI中进行BLAST，结果∞显示其与GeneBank中已发表序列同源性高■达99%，由此进ω　一步确定其为SVV，将其命名为SVV?HN16。以GeneBank中已发表的13株SVV毒株为参考（表1），进行SVV?VP1基因同源性分析（图3）。

图3　基于SVV?VP1基因的序列同源性

结果显示，SVV?HN16?VP1基因之←间核苷酸序列同源性为85%～96.9%：其中与中国已公布毒株相比核苷酸同源性为94.7%～95.1%；与巴西毒株相比□　核苷酸同源性为93.9%~96.9%；与美国毒株核苷酸同源性为85.0%～86.5%。巴西毒株与国内毒株相比，同源性为95.9%～97.2%。该毒株与巴西毒株同源性最高，为96.9%, 与美→国毒株同源性最低，为85.0%。

2.4　基于SVV?VP1基因的遗传进化分析

以表1中13株毒株为参考，运用MEGA 6.06软件采用Neighbor-Joining聚类分析方法构建基于VP1基因序列的进↓化树。如图4所示，SVV?HN16与国㊣　内毒株亲缘关系较近，而与美国毒株较▲远。本次鉴定毒株与国

内其他毒株虽然亲缘关系较近，但单独形成一个『分支，说明该病毒是SVV新成员。

图4　基于SVV?VP1基因的遗传进化树

3　讨论

SVV最初分离自细胞培养基，怀疑有可能来⌒　自猪胰蛋白酶或胎牛血清。在2007年，SVV在美国和加拿大的猪群中①被分离到，在美国和▓巴西等地，该病毒仅有零星报道，直至2014年11月到2015年4月，巴西出现几次严重的感染症状，并导致巨大经济损失，该病才逐∮渐被重视。在2015年9月，该病在美国某猪场暴发，并伴随大量新生仔猪死亡。在2016年，国内首株塞内加谷病毒被报道，该ㄨ病开始传入我国并威胁着我国的养猪业。

本∮次鉴定出的SVV?HN16与国内其他毒株不在一个分支，表明在进化过程中变异迅速，这种变异对疾病的防治和疫苗的研究增加了难◥度。对该病毒使用细胞进行增殖，目前已传至第8代，且能出现稳定的病变，有望对新疫苗的研ぷ制提供帮助。因该病是猪场新病，对其认知比较╳有限，且发病率较高、传播快、猪场损失大，对猪场短期及长期的影响难以预估，需要进一步∩研究其传入源头、防控方法，做好防控方案。