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本文作者：耿雯，秦丰，任佳绪，徐晓鹤，王爱媛
作者单位：110004　辽宁省沈阳市，中国医科大学附属盛京医院眼科

摘要目的　研究核糖体蛋白L41（ribosomal protein L41，RPL41）对人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法　将人视网膜母细胞瘤Y79细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培ζ养液中传代培养。根据药物处理浓度分为对照组（RPL41浓度为0 μmol·L^-1）、40 μmol·L^-1 RPL41处理组、80 μmol·L^-1 RPL41处理组、120 μmol·L^-1 RPL41处理组。CellTiter-Glo荧光〖细胞活性检测系统检测各组细胞活性；流式细胞仪检测100 μmol·L^-1 RPL41处理后细胞凋亡率，Hoechst染色观＠ 察细胞凋亡形态；Western blot检︾测各组细胞中活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）的含量。结果　与对照【组相比，40 μmol·L^-1 RPL41处理组细胞Ψ活性为（97.9±1.5）%，无明显变化，差异无统计学意义（P=0.055）；80 μmol·L^-1 RPL41处理组细胞活性为（87.6±1.8）%，120 μmol·L^-1 RPL41处理组为（63.9±2.0）%，与对照组相比◥♀差异均有统计学意义（均为P<0.05）。RPL41对Y79细胞增殖〗有明显的抑制作用。100 μmol·L^-1RPL41能够促进Y79细胞凋亡，凋亡率为（17.33±2.47）% 。100 μmol·L^-1RPL41处理组凋亡细胞与正常细胞相比，细胞颜色较亮，细胞体积较小。40 μmol·L^-1 RPL41处理组ATF4蛋白含量为0.76±0.04，80 μmol·L^-1 RPL41处理组为0.29±0.04，120 μmol·L^-1 RPL41处理组为0.29±0.05，与对照组相比，差异均有统计学意义（均为P<0.01）。RPL41能够降低Y79细胞中ATF4的蛋白含量。结论　RPL41能抑制人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖，诱导「细胞凋亡，其作用机制可能与ATF4有关。

????视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是小儿最常见的原发性眼内肿瘤，严重危害患儿的视力和生命健康。目前临床对小儿RB常规的治疗方法包括眼球摘除、冷冻疗法、激光光凝、全身或局部化学治疗▆、放射治疗等，化学治疗联合局部治疗是现阶段国际上的首选疗法^［1-2］。核糖体蛋白L41（ribosomal protein L41，RPL41）是新近发现的一个抑癌基ω因，在多种肿瘤细胞中低表达^［3］。合成的小分子多肽RPL41能够特异性降解肿瘤细胞内质网应激关键因子——活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4），破坏肿瘤细胞自身的ω　保护应答机制，导致细胞死亡^［4］。本实验旨在研究RPL41对人RBY79细胞增殖和凋亡的影响，探讨其作卐用机制，为RB的治疗提◆供新的思路和理论依据。

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材料与方法

1.1　材料和试剂　人RB Y79细胞株（美国模式培养物集存库）；RPL41（规格：100 mg，纯度≥95%）由南京Genscript公司合成；RPMI 1640培养基、胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；CellTiter-Glo荧光细胞←检测试剂盒（美国Promega公司）；Annexin V-FITC凋亡试剂盒（美国Ebioscience公司）；Hoechst3334染色︾试剂盒、山羊抗兔二抗（美国Thermo Fisher Scientific公司）；兔抗鼠抗体ATF4（美国Proteintech公司）；内参β-actin（美国Santa Cruz公司）。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养及药物处理　将Y79细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养∮箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。为最大限度保持多肽的活性，用双蒸水溶解RPL41速冻干粉至终浓度10 mmol·L^-1，分装于-80 ℃冰箱保存。细胞加药前，取分装的RPL41，加入双蒸水稀释为2 mmol·L^-1溶液。根据药物处理浓度分为对照组（RPL41浓度为0 μmol·L^-1）、40 μmol·L^-1 RPL41处理组、80 μmol·L^-1 RPL41处理组、120 μmol·L^-1 RPL41处理组。
1.2.2　细胞活性检测　取指数生长期的人RB Y79细胞，1000 r·min^-1离心5 min。弃上清后，用无血清1640培养基将△细胞悬起，根据实验需求调＠ 整细胞数每孔为50×10³个至96孔板中，轻轻混匀。加入不同体积的RPL41，使RPL41最终浓度分别为40 μmol·L^-1、80 μmol·L^-1、120 μmol·L^-1。20 min后每孔各加入10 μL纯血清，继续培养24 h。检测细胞活性时，用8道排枪加入100 μL CellTiter-Glo荧光细胞检测试剂，振荡2 min，室温静置10 min。酶标仪读取荧光值。细胞活性=（给药组荧光值-背景荧光值）/（对【照组荧光值-背景荧光值）。
1.2.3　细胞凋亡情况检测　取指数生长期的人RB Y79细胞，离心弃上清，用无血清培养基悬起，调整细胞数每孔为100×10³个至6孔板中。加↓入相应体积RPL41使其终浓度为100 μmol·L^-1，20 min后每孔各加入200 μL纯血清，继续培养24 h，将细胞悬液■离心（1000 r·min^-1离心5 min）。弃上清液，加 1 mL PBS清洗一次。用200 μL Binding buffer制备单细胞√悬液，每管加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，再加入10 μL PI混匀，避光，室温下反应15 min，1 h内流式细胞仪检测。设置空细胞对照，并按要求设置重复。
1.2.4　Hoechst染色　Hoechst是一种能穿透细胞膜的DNA荧光染料，能将正常细胞染成≡淡蓝色。当细胞发◥生凋亡时，细胞呈现染色质浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质被分割成块状，出现凋亡小体等典型的凋亡形态^［5］。人RB Y79细胞经100 μmol·L^-1 RPL41处理，继续培养24 h。40 g·L^-1多聚甲〇醛固定10 min后，加Hoechst33342染色，Hoechst33342终浓度为1 mg·L^-1，室温避光孵育10 min，在倒置荧光显微镜下观察，拍照。
1.2.5　Western blot检测ATF4含量　人RB Y79细胞经40 μmol·L^-1、80 μmol·L^-1、120 μmol·L^-1 RPL41处理，继续培养24 h。收集细胞，冰上裂解细胞，BCA法进行蛋白定量。上样量20 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电①泳，电转移至PVDF 膜，50 g·L^-1脱脂牛▂奶室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，抗≡体稀释浓度为1∶500。TBST洗3遍，加入二抗，室温孵育1 h。ECL化学发光。用凝胶图像处理系统Image J分析目标条带的相对分子质量和光密度值。
1.3　统计学方法　采用GraphPad Prism 7.0统计软件进行统计分析，数据采用x?±s表示。两组比较采用】t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

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结果

2.1　RPL41对人RB Y79细胞增殖的影响　不同浓度的RPL41处理人RB Y79细胞后，用CellTiter-Glo荧光细胞检测系统◎检测细胞活性。与对照组相比，40 μmol·L^-1 RPL41处理组细胞活性为（97.9±1.5）%，无明显变化，差异无统计学意义（P=0.055）；80 μmol·L^-1 RPL41处理组细胞活性为（87.6±1.8）%，120 μmol·L^-1 RPL41处理组为（63.9±2.0）%，与对照组相比差异均♀有统计学意义（均为P<0.05）。RPL41对人RB Y79细胞增殖有明显的抑∴制作用。
2.2　RPL41对人RB Y79细胞凋亡的影响　100 μmol·L^-1 RPL41处理人RB Y79细胞24 h后，使用Annexin V/PI流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测，结果表明与对照组相比，100 μmol·L^-1RPL41能够々促进人RB Y79细胞凋亡，凋亡率为（17.33±2.47）%，差异有统计学意义（P<0.01，见图1）。



2.3　Hoechst染色观︼察细胞凋亡形态　Hoechst染料与DNA的A-T碱基区结合，紫外光激发时发出明亮的蓝紫色光。对照组正常的人RB Y79细胞为∮淡蓝色圆形颗粒，细胞形态大而规♀则；100 μmol·L^-1RPL41处理组凋亡细胞与正常细胞相比，细胞颜色较亮，细胞体积较小(图2)。



2.4　Western blot检测人RB Y79细胞中ATF4蛋白的〇含量　分别用不同浓度的RPL41处理人RB Y79细胞，24 h后检测各组细胞中ATF4蛋白含量。40 μmol·L^-1 RPL41处理组ATF4蛋白含量为0.76±0.04，80 μmol·L^-1 RPL41处理组为0.29±0.04，120 μmol·L^-1 RPL41处理组为0.29±0.05，与对照组相比，差异均有统计学意义（均为P<0.01）。RPL41能够降低╱人RB Y79细胞中ATF4蛋白的含◥量（图3）。

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讨论

????目前治疗RB的药物均有很强毒性，尤其有耳毒性、肾毒性，并可继发白血病等，对儿童有』很大的危害，有些№可能诱发机体耐药，对中晚期RB的疗效不佳^［6］。因此，如何提高▃药物疗效，减少细胞耐药性和机体不良反应，成为RB治疗的研究热点。
????ATF4是调节∏肿瘤细胞在应激环境下生存的一个重要应激反应基因，其参与的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路是内质网应激的重要通路之一^［7］。肿瘤细胞在各种应激信号作用下，通过PERK信号转导通路诱导真核转录起始因子2α磷酸化，特▽异性增加ATF4 mRNA的翻译，以促进肿瘤细胞在应激环♀境中的自适应↘性保护反应。目前发现ATF4主要经由以下三个方面对肿瘤细胞进行调控：（1）通过调节与线粒体功能、氨基酸代谢和转运以及氧化还原反应相关的一些基因来保证蛋白生物合成所需要的氨∑基酸，以合成应激条件下维持细胞生存最低限度的必需蛋白，在调节细胞损伤修复和凋亡过程中发挥重▲要作用^［8］；（2）与恶性肿瘤的浸润和转移密切相关，ATF4能够通过调◣节VEGF-A、内皮细胞选择素、尿激酶型纤溶酶原激活剂促进肿瘤细胞转移^［9-11］，上述因子都是肿瘤治疗的潜在靶点；（3）与细胞的耐药性也密切相关^［12］，其机制尚不清楚，目前认为可能与ATF4诱导细胞自噬，促进DNA损伤修复，以及上调细胞内谷胱甘肽等有关。综上所述，ATF4是々肿瘤细胞在多种细胞应激信号下被激活的一个重要转录因子◥，抗ATF4已成为肿瘤治疗的一个新靶点。
????RPL41是我〓们前期发现的一个新的肿瘤抑制基因，合成的RPL41蛋白多肽是一种富含精氨酸和赖氨酸的小分子多肽，相对分子质量非常小，渗透性强，能够自行穿越细胞膜☆，易被肿瘤组织摄取╱^［13］，具有研发抗肿瘤药物的重要优点。RPL41能够诱导ATF4蛋白磷酸化，使其从细胞核移位至细◆胞浆蛋白酶体中迅速降解，是目前唯一一种抗※ATF4的药物。而RPL41本身与细胞有丝分裂→密切相关，敲除RPL41基因后，细胞有丝分裂出现异常，导致细胞恶性转化^［3］。本实验证实了经RPL41处理的人RB Y79细胞，细胞活性明⌒显降低，凋亡率上升，机制可能与其特异性降解细胞中ATF4含量有关。此外，本课题组研究发现，RPL41可以和其他抗肿瘤药物联合发挥抗肿瘤作用。在低√剂量使用时，RPL41能够增加肿瘤细胞A549对DNA损伤化学治㊣　疗药物顺铂的敏感性^［4］，说明在达到↙对肿瘤疾病同等治疗效果时，RPL41会减少化学治疗药物的用量，从而减轻化学治疗药物的毒副作用。

参考★文献略

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