银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病,其主要病理特征为角质形成细胞过度增殖,导致表皮可凋亡的角质形成细胞异常分化,并伴随皮肤炎症浸润及血管生成异常等。银屑病病程较长、易复发且较难治愈。目前关于银屑◥病的发病原因和机制尚无定论,但普遍认为与遗传和环境相关Notch 信号通路由多种分子及¤蛋白组成,参与多种疾病的发生过程,与银屑病的发生密切相关。目前研↘究较多的是 Notch?信号通路与免疫介导机▆制在银屑病发病中的作用 。角质形成细胞是构成表皮结构的主要细胞,约占表皮细胞总数的 80%?。多种皮肤肿瘤及炎症性皮肤病的发生与角质①形成细胞增殖、凋亡、分化异常相关 。HaCaT?细胞是从成人皮肤中分离的永生化角质形成细胞系№,其遗传特性稳定,增殖、分化特性与♂角质形成细胞相似,在进行实验研究时常用来替代角质形成细胞。2014 年 4月 ~ 2015 年 6 月,本研究观察 Notch 信号通路关键因子在银屑病皮损区皮肤中的表达情况及对※ HaCaT
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细胞增殖、凋亡及分化的影响,探讨 Notch?信号通路在银屑病发病中的作用机制。
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材料与︾方法
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1. 1 皮肤组织标本来源 选择同期山东省中医院就诊的斑】块型银屑病患者 30?例( 病例组) ,均经皮肤组织病理检查确诊。其中男 18?例、女 12?例,年龄18 ~ 75( 32. 6 ± 7. 4) 岁。采集患者◇皮损区皮肤组织为病例组,同时采集距々皮损区 1 cm?非皮损区皮肤组织作为对照组。纳入标准: 皮损区近 2?周未外涂药物,近 1?个月未接◤受免疫抑制剂及其他药物治疗。排除标准: 年龄 <?18?岁或 >?75?岁; 合并皮肤肿瘤或其他增生性皮肤病; 有心■脑血管、肝、肾及造血系统等严重原发性疾病或其他情况不适合取材者。同期选取本院皮肤科留存的健康人皮肤□组织样本 30?例作为正常组,健康人男 16 例、女 14 例,年龄 18 ~ 69
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( 34. 2 ± 6. 8) 岁。三组性别、年龄比较差异无统计学意义( P 均 > 0. 05) 。三组去除皮下结缔组织与皮①下脂肪后,于液氮中速冻,- 80 冰箱中保存备□ 用。
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1. 2细胞、试剂及仪器人永生化角质形成细胞系 HaCaT,购于中国科学院细→胞库。Notch 信号通路特异性激活剂( Jagged1-Fc 融合蛋白) 和 Notch 信号通路特异性阻断剂( DAPT) ,购于美国 R&D System 公司; TRIzol、逆转录试剂盒、荧光定↓量试剂 ( SYBR Green I) ,购于日本 TaKaRa 公司; Notch1、Jagged1、B淋巴细胞瘤 / 白血病-2 ( Bcl-2 ) 、Bcl-2 相关 X 蛋白 ( Bax) 、角蛋白 1 ( Keratin1) 和重组人外▲皮蛋白( In-volucrin) 单克隆抗卐体,购于美国 Abcam 公司; 辣根过氧化物标记的二抗,购于北『京中杉金桥生物技术有限公司; DMEM 培养基、100 μg / mL 碘化丙啶( PI) 、Annexin-V-FITC,购于美国 Sigma 公司; MTT 试剂盒购于普洛麦格北京生物技术有限公司; BCA 蛋白定量试剂盒、5 × SDS 蛋白上样缓冲液,购于⌒ 天根生化科技有限公司; FBS,购于杭州四季青生物工程材料研究所。CO2 培养箱,购于▓常州菲普实验仪器厂; 倒置显微镜,购于日本尼康; RT-PCR 仪,购于瑞士Roche 公司; 流式细胞▼仪,购于美国 BD 公司; Multi-skan MK3 型酶标仪,购于芬兰 Thermo Labsys2tems公司。
1. 3细胞培养及处理从液氮罐中取出装有HaCaT 细胞的冻存管,放入 37恒温水浴锅中快ㄨ速解冻,待细胞冻存液融解后,将细胞移至 5 mL 无菌离心管中,加入含有 10% FBS 的 DMEM 培养液
3 mL稀释冻存液中的 DMSO,1 000 r / min 离心
5 min,去除◥上清液。加入新的培养液吹打重悬细胞沉淀,接种到细胞培养皿中,置于 37 ,5% CO2 培养箱╳中培养。细ぷ胞贴壁后换液 1 次,去除漂浮的死细胞,之后定期换液,待细胞融合度达 80% 以上时,用0. 25% 的胰酶消化并收集细胞,按 1 3 的比例进行传代培养∩。取对数生长期的 HaCaT 细胞,去除细胞培养液,用 PBS 清洗细胞 2 次,用 0. 25% 的胰酶消化,待细胞呈单个存在时终止消化,离心收集细胞沉淀。用培养液重悬、计数后,将细胞〖浓度调整为 5 × 104 / mL,每孔 200 μL 接种于经紫外照射灭菌的96 孔培养▽板中,置于 37、5% CO2 ?培养箱中培养24 h后,去除细胞培养液,将细︻胞随机分为 Jagged1-Fc 融合蛋白组、DAPT 组、常规对照组,分别加入含 ( 终浓度 0、0. 5、1、2 μg / mL) Jagged1-Fc 融合蛋白、 ( 终浓度 0、5、10、20 μmol / L) DAPT、常规细胞培养液进行培养。
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1. 4皮肤组织@中 Notch1、Jagged1 mRNA 表达检测
用RT-PCR 技术。取三△组皮肤组织,用 TRIzol 法提取总RNA。紫外分光光度计检测总 RNA 浓度,琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 质量; 用 PrimeScriptTM RTReagent kit 逆转录试剂盒合成●将 RNA 逆转录成cDNA,用 RT-PCR 试剂盒检测。根据 GenBank 数据库中公布的人 Notch1 和 Jagged1 mRNA 序列,用Primer5. 0 软件设计 RT-PCR 引物,送上海派森诺生物科技有限公司合成,引物序列为 Notch1-F: 5'-GT-CAACGCCGTAGATGACCT-3',Notch1-R: 5'-CAGGTT-GTACTCGTCCAGCA-3';Jagged1-F: ?5'-GTCCCACTG-GTTTCTCTGGA-3',Jagged1-R: ?5'-CCACAGACGTTG-GAGGAAAT-3'; ?β-actin-F: 5'-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3',β-actin-R: 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-G-3'。RT-PCR 扩增条件: 预变性 95 5 min,变性 95 30 s,退火 60 30 s,延伸 72 30 s,35 个循环。用 β-actin?作为内参,采用 2?-?Ct?法计算目的基因相对表达量。
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1. 5皮肤组织中 Notch1、Jagged1 蛋白及 HaCaT 细胞内 Bcl-2、Bax、Keratin1、Involucrin 蛋白表达检测采用 Western blotting 法。取三组皮肤组织,按照蛋白提取试剂◥盒说明书提取皮肤组织总蛋白; HaCaT细胞 经 Jagged1-Fc?融 合 蛋 白、DAPT?处 理。用0. 25% 的胰酶消化、收集细胞,按照蛋白提取试剂盒说明书提取 HaCaT?细胞总蛋白。按照试剂◥盒说明书测定组织及细胞总蛋白浓度。蛋白上清液稀释至统一浓度后,与 Loading buffer?按体积 4 1?混匀,100煮沸 5 min?使蛋白变性。将变≡性蛋白样品加入SDS 蛋白凝胶上样孔中,每孔 50 μL,常规方法垂直电泳。电泳结束取█出蛋白凝胶,按照滤纸、PVDF膜、蛋白凝胶、滤纸的顺序㊣在 4转膜过夜。PBST洗涤 3 次,PVDF 膜用 5% 脱脂奶粉封》闭 2 h,然后依次与一抗( 500 倍稀释) 、二抗( 1 000 倍稀释) 孵育,滴加 ECL 显色液,在暗室中曝光,用 Odyssey 成像系统扫描各条带灰度值,β-actin 条带作为内◢参照。目的蛋白相对表达量 = 目的蛋白灰度值 / β-actin 灰度值。
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1. 6HaCaT 细□ 胞增殖活力检测采用 MTT 法。
HaCaT 细胞经 Jagged1-Fc 融合蛋白、DAPT 处理,置于 37 、5% CO2 培养箱中培养 24、48、72 h,每孔加入 0. 5% 的 MTT 溶液 20 μL,继续培养 4 h,弃去培养液,加入 DMSO 150 μL,低速振荡 10 min 溶解蓝紫色结晶。用空白调零孔调零,用酶标仪测定波长 570 nm 处光密度 ( A) 值,A 值♂与细胞数量呈正比,以 A 值作为评价细胞增殖活力的指标。
1. 7HaCaT 细胞凋亡率检测采用流式细胞术★。
取对数生长期的 HaCaT?细』胞分别用终浓度为 2?μg /mL 的 Jagged1-Fc 融合蛋白、终浓度为 20 μmol / L DAPT 处理 72 h,弃去细胞培养液,PBS 清洗细胞 2次,加入 0. 25% 的胰蛋白酶消化、收集细胞,以不做处理的细♀胞作对照。细胞计数,用细胞培养液重〓悬细胞,调整细胞为 1 × 106 / mL。取细胞悬液 1 mL 加入 1. 5 mL 离心管中,4,1 200 r / min,离心 5 min,弃上清液。向细胞∑沉淀中加入 Binding Buffer 200μL,充分混匀后分别加入 PI 5 μL 和 Annexin V-FITC 5 μL,避光室温「孵育 20 ~ 30 min,加入 Binding Buffer 400 μL,用流式细胞」仪检测 HaCaT 细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率≡。
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1. 8统计㊣ 学方法采用 SPSS21. 0 统计软件。计量资料用 x珋± s 表示,比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析●,进一步两两比较采用 LSD-t 检验。P < 0. 05 为差异╲有统计学意义。
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