SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性〓(Polymorphism)。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于度多◢态性(RFLP)分析还是微卫星标记「(STR)，都要广泛得多。

实验方』法原理：

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于限制性片段长度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的最小单位,据估计，人类的所有群体中大←约存在一千万个SNP位点。一般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传▆给后代。于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点╲称作单体型（haplotype）。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个〓具有至少5%的频率），它们代表了一个群体中人与人之间的大部№分多态性。一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标卐签SNPs(tagSNP)来进行基因分型，获取大部分的遗传多态※模式。

实验材料：

组织样品

试剂、试剂盒：

液氮、PBS、GA缓冲液、GB缓冲液、蛋白酶K、无水乙醇、蛋白液、漂洗液等

仪器、耗材：

离心管、离心机、废液收集管、吸附柱、水浴锅、分光光度计、低温冰箱等

实验步骤：

一、DNA抽提

1.? 取新鲜肌肉组织约100 mg，PBS漂洗干净，置于1.5ml离心管中，加入液氮，迅速磨碎。

2.? 加200 μl 缓冲液GA，震荡至彻卐底悬浮。加入20 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混匀。

3.? 加220 μl 缓冲液GB，充分混匀，37℃消化过夜，溶液变清亮。加220 μl无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

4.? 将上述一Ψ 步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB 中，（吸附柱放入废液收集管中）12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。

5.? 加入500 μl 去蛋白液GD（使用前⊙请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。

6.? 加入700 μl 漂洗液GW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm离心30 秒，弃掉废液。加入500 μl 漂洗液GW，12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。将吸附柱CB 放回废液收集管中，12 000 rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗液。

7.? 将吸附柱CB 转入一个干净的离心管中，加入100 μl 洗脱缓冲液（洗脱缓冲液应在60-70℃水浴预热），混匀，室温放置15 分钟，12 000 rpm 离心30秒。洗脱第二次，将洗脱缓冲【液50 μl 加入吸附柱中，室温放置15 分钟，12 000 rpm 离心30秒。

8.? 采用Beckman DU 640 spectrophotometer 检测提取到的基因组DNA浓度，在OD260 处有显○著吸收峰。同时检测纯度，OD260/280的值应为为1.7-1.9。

9.? 从原液中取出相应体积DNA 溶液，稀释致50 ng/ul，原液置于-70℃保存，稀释液〖置于-20℃保存。

二、 PCR扩增目的片段

1.? 按相关的试剂说明在标准反应管中准¤备反应体系，典型的PCR反应体系如下（20 ul体系）

2.? 向左扳动仪器盖子上的手柄，揭开仪器盖子，小☆心放置样品管于仪器的相应样品孔中，轻轻盖上盖子，将顶部的旋钮慢慢旋紧，让热盖紧密接触①样品管，样品放置完毕。

三、 在T1型PCR仪上编辑一个程序

1.? 按[C programs]进入编辑模式。要在主目录中♂创建一个程序请按[D enter]。要进入一个子目录，用→键将光标向右移动，然后用↑↓键选择※一个子目录。按[D enter]进入选择的子目录。

2.? 输入程序中要求的温度：用[D enter]确认温度。为其输入时间↑，用小数点来间隔】。顺序为h.m.s。用[D enter]确认时间设置，或者用光标键移动到下一个区域。＃表示循环的次々数。设定循环值=总循环值-1，即，总循环数为30时应输入“29”。用[C pgm ok]来储存一个完◤整的程序。程序数据永久的储存在记忆中。

四、运行程序

按[B start/stop]选择①一个程序。用→↑↓键选择一个子目录，或者用[Denter]进入□主目录。输入您想要启动的程序的号码。或者，按[A list]在该子目录中的所有程序的列表中选择一个程序。用↑↓键在列表中滚动选择。用[D enter]确认用□　强光突出的程序。按[D start]启动程序。

五、控制测试过程

运行过程中，按A按钮，可以获得程序剩余的时间◣信息。运行完成后，按STOP按钮终止实验，按YES确认终止。小心旋↓开热盖，按照放置样品的操作▲顺序，打开盖子，取出实验样品，再盖上盖子，关闭电源，本次实『验结束。

六、PCR产物测序

由专门负责测序的服务公司完成。

七、数据分析

少量可人工读取，大量⌒　可软件读取。比对发▓现的SNP在基因组中的位置：重点是启动子区、外显子区域（包括编码区的cSNP及5’及3’UTR）、剪切边界等，密码子的改变是否导致氨ㄨ基酸的改变：错义突变、无义突变、终止突变。

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注意事项：

1.? 为保㊣证待测目的区域测序真实可靠，引物设计应该使待测目的区域边界距离上下游引物至少各50 bp；

2.? 引物设计建议使用在线方式，以保证成功率；

3.? 为保证测序敏感性，PCR产物片段大小应在250 bp－650bp范围；

4.? 为方便╳实验，建议引物合成时分装成1 o.d/管，方便将PCR与测序的引物分开；

5.? 为保证∩引物的特异性，建议引物设计后在NCBI上blast确认；

6.? 为防止降解，PCR产物应尽快测序◤，否★则应该保存在-20℃，且时间不宜过长；

7.? 为保证结果真实性，建议对关键点进行反向测序确▽认。